МИТОТИЧЕСКОЕ ДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК

МЕЙОЗ

РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ

Практический тест: митоз и мейоз

Клеточный цикл представляет собой однонаправленный процесс, где клетка последовательно проходит разные его периоды, без их пропуска или возврата к предыдущим стадиям. Вступив в клеточный цикл, клетка его заканчивает синтезом ДНК и делением клетки (рис. 345).

Рис. 345. Схема клеточного цикла

Однако, как уже говорилось, клетки могут выходить из цикла, переходить в стадию покоя, или в G₀-стадию. В многоклеточных организмах многие клетки теряют способность к пролиферации, к размножению, теряют способность переходить из стадии покоя в новую стадию пролиферации, в G₁-стадию, которая начинает путь клетки к ее делению. К таким клеткам относятся нейроны, кардиомиоциты, клетки хрусталика и многие другие. Существуют также органы с редко делящимися клетками; так, например, клетки печени могут входить в клеточный цикл через несколько месяцев покоя. Быстро размножающиеся клетки взрослых организмов, такие как кроветворные, или базальные клетки эпидермиса и тонкой кишки, могут входить в клеточный цикл каждые 12-36 ч. Самые короткие клеточные циклы, около 30 мин, наблюдаются при быстром дроблении яиц низших организмов (иглокожие, земноводные). В экспериментальных условиях короткий (20 ч) клеточный цикл имеют многие линии клеточных культур.

Что определяет вступление клеток в пролиферацию и что определяет закономерную последовательность смены периодов клеточного цикла — эти вопросы долгое время оставались без ответа.

Считалось, что для начала вступления в клеточный цикл необходимы рост живой массы клетки, образование веществ для деления, в частности ДНК и белка, создание определенного уровня энергетических запасов и т.д.

Фактор стимуляции митоза

Расшифровка регуляции процессов клеточного деления началась в 70-е годы прошлого века, когда были найдены методы слияния разных клеток, методы получения гетерокарионов (см. раздел "Методы клеточной биологии"). Оказалось, что можно получить слияние не только интерфазных клеток с интерфазными, но и интерфазных с митотическими клетками (см. рис. 114). При этом обнаружилось удивительное явление: в такой гибридной клетке, где были митотические хромосомы одной из исходных клеток, в ядрах от интерфазных клеток начиналась конденсация хромосом, разрушалась ядерная оболочка и образовывались так называемые преждевременно конденсированные хромосомы (ПКХ, или РСС — preliminary condenced chromosomes). Причем структура ПКХ зависела от стадии интерфазного ядра: в ядре от: G₁-клетки появлялись однонитчатые длинные ПКХ, в ядре от G₂-клетки ПКХ были двойными (так как после S-периода хромосомы удвоились). Эти наблюдения наводили на мысль, что при слиянии таких клеток на интерфазные ядра действуют какие-то факторы, содержащиеся в митотических клетках. Для проверки этого предположения были поставлены опыты со слиянием клеток на разных стадиях клеточного цикла, что представлено ниже.

Эти эксперименты были дополнены тем, что часть цитоплазмы митозной клетки инъецировали в цитоплазму G₁-интерфазной клетки. Это приводило к появлению в ядре интерфазной клетки ПКХ. Из этих наблюдений был сделан ввод о том, что в цитоплазме митотической клетки есть фактор (или факторы), стимулирующие митоз (ФСМ, или MPF - mitosis promoting factor). Этот фактор вызывает не только конденсацию хромосом, но и приводит к распаду ядерной оболочки, т.е. переводит интерфазную клетку, даже без синтеза ДНК, в митотическое состояние (конечно, дальше появления конденсированных хромосом развитие митоза не идет).

Параллельно с этими наблюдениями были проведены эксперименты на созревающих и дробящихся яйцеклетках лягушек X. laevis (рис. 346).

Рис. 346. Обнаружение фактора стимуляции созревания (MPF) ооцита Xenopus а — нормальное развитие: 1 — ооцит на стадии профазы I деления, 2 — ооцит на стадии I метафазы, 3 — ооцит на стадии II метафазы, 4 — зигота, 5 — I деление дробления; ПР — стимуляция прогестероном; ОП — оплодотворение; б — инъекция цитоплазмы из неделящейся яйцеклетки в такую же не вызывает созревания - перехода в метафазу; в — инъекция цитоплазмы из метафазной клетки в неделящуюся индуцирует ее переход в метафазу (созревание ооцита)

Ооцит X. laevis после репликации ДНК и короткой G₂-стадии переходит в мейотическую профазу I, во время которой в течение восьми месяцев происходят рост и созревание ооцита, он дорастает до размера зрелой икринки. При спаривании овариальные клетки самки выделяют гормон прогестерон, который стимулирует переход из профазы и I мейотическое деление (митоз I), затем после короткой интерфазы наступает II мейотическое деление, которое на некоторое время останавливается на стадии метафазы (стадия яйца). При оплодотворении спермием метафаза завершается, происходит второе деление меойза, после чего гаплоидное ядро яйцеклетки сливается с ядром спермия и образуется диплоидная зигота. После этих событий следуют через каждые 30 мин многочисленные деления клеток развивающейся бластулы (см. рис. 346, а).

Если взять с помощью микроманипулятора небольшую часть цитоплазмы из ооцита на стадии метафазы II мейотического деления и инъецировать ее в цитоплазму не стимулированного прогестероном ооцита, то произойдет повторение описанного выше процесса: ооцит вступит в I деление мейоза, а затем и во II деление, т.е. произойдет его созревание (см. рис. 346, в). Таким образом было найдено, что в ооците на стадии метафазы II деления в цитоплазме существует фактор (или факторы), стимулирующий созревание яйцеклетки (ФСС, или MPF — maturation promoting factor).

Оказалось, что этот фактор (будем называть его MPF) присутствует в клетках только во время митотического состояния. Он обнаруживается также и во время дробления яйцеклетки (рис. 347). Таким образом, уровень MPF в интерфазных клетках низкий, а в митотических высокий.

Рис. 347. Колебание уровня фактора стимуляции созревания (MPF) в процессе мейотических и митотических делений при созревании и дроблении яйцеклетки Xenopus ПР — стимуляция прогестероном; ОП — оплодотворение. I — метафаза I мейотическот деления; II — длительная метафаза II мейотического деления. 1, 2, 3 — деления дробления зиготы

Далее было найдено, что при инъекции цитоплазмы из митотических клеток культуры ткани в нестимулированный ооцит X. laevis происходит созревание ооцита. Следовательно, фактор, стимулирующий митоз, и фактор, стимулирующий созревание ооцитов, - одно и то же.

Этот фактор — MPF, был выделен и охарактеризован. Это гетеродимерный комплекс, состоящий из белка циклина (см. далее) и зависимой от циклина протеинкиназы (cyclin dependent kinase — Cdk), фермента, относящегося к фосфорилазам, который модифицирует белки, перенося фосфатную группу от АТФ на аминокислоты серин и треонин. Следовательно, MPF состоит из двух субъединиц: каталитической (Cdk) и регуляторной (циклин) (рис. 348).

Рис. 348. Структура фактора, стимулирующего митоз (MPF) 1 — циклин; 2 — зависимая от циклина неактивная протеинкиназа; 3 — активный MPF

Циклины

Циклин был обнаружен при изучении включения меченых аминокислот в синхронно дробящиеся яйца морского ежа. В одном из белковых пиков на электрофореграммах метка периодически то появляется, то исчезает: она появлялась после клеточного деления, постепенно возрастала к митозу, а затем ее уровень падал после анафазы, и по том снова начинал возрастать в следующей интерфазе. Этот белок был назван циклином. Он постоянно синтезируется в течение эмбрионального клеточного цикла и резко разрушается при вступлении в анафазу. Подобный митотический циклин В был обнаружен у всех эукариот, в том числе и у X. laevis.

В раннем эмбриогенезе, т.е. при дроблении яиц X. laevis, первые 12 делений идут друг за другом при минимальной величине G₁- и G₂-периодов, и возрастание уровня MPF происходит во время каждого деления. Интересно, что дробление яиц и циклические изменения активности MPF осуществляются также без участия ядер. Это значит, что для появления активности MPF не нужна транскрипция информационных РНК. В этот период все клеточные белковые синтезы идут на долгоживущих матричных РНК, синтезированных еще во время роста ооцитов в мейотической профазе.

Расшифровка природы активности MPF была получена на модельных экспериментах с использованием цитоплазматических экстрактов активированных яиц X. laevis. В этих экстрактах были все компоненты для поддержания клеточного цикла: ферменты и предшественники для синтеза ДНК, гистоны и другие белки и липиды для образования ядерной оболочки, так же как и иРНК, необходимая для синтеза белков, и в том числе циклина В.

Если к такому экстракту добавить хроматин из спермиев X. laevis, то вокруг хроматина образуется ядерная оболочка, затем происходит синтез ДНК, конденсация хромосом, разрушается ядерная оболочка, образуется митотическая фигура и потом наступает интерфаза, цикл повторяется через каждые 20 мин. По мере прохождения каждого цикла сначала в интерфазе нарастал циклин В параллельно возрастанию активности MPF. В митозе после анафазы количество циклина В и активность MPF падали, т.е. наблюдалось циклическое изменение двух параметров (рис. 349). По мере возрастания уровня MPF при повышении активности Cdk происходила конденсация хромосом за счет фосфорилирования конденсинов и гистона H1, распад ядерной оболочки при фосфорилировании ламинов, образование веретена деления, т.е. все атрибуты митотического аппарата.

Рис. 349. Динамика MPF и циклина в цитоплазматических экстрактах ксенопуса а — циклические возрастания уровней MPF (2) и циклина В (3) после активации хроматина спермием (ХР), при этом в экстракте образуются митотические фигуры (1); 6 — РНКазная деградация иРНК в экстракте приводит к исчезновению цикличности MPF и циклина В; в — добавление к экстракту новой иРНК циклина В (показано стрелкой) возобновляет характерную динамику циклирования MPF

Деградация циклина В в анафазе вызывается сложной цепочкой белковых взаимодействий, которые приводят к его расщеплению с помощью сложных белковых протеолитических комплексов — протеосом. Кроме того, в начальных этапах деградации циклина участвует сложный белковый комплекс АРС (комплекс, стимулирующий анафазу), который не только подготавливает циклин к деградации, но одно временно приводит к деградации когезинов, удерживающих хроматиды друг с другом вплоть до анафазы.

Общая схема регуляции митотического циклина В и MPF и циклирующих клетках может быть представлена на рис. 350.

Рис. 350. Регуляция митотического циклина в постоянно делящихся (циклирующих) клетках эмбрионов Циклин В (С) и циклинзависимая протеинкиназа (Cdk) образуют фактор, стимулирующий митоз (MPF). 1 — метафаза; 2 — полиубикитинизация циклина В; 3 — его деградaция; 4 — поздняя анафаза; 5 — телофаза; 6 — интерфаза; 7 — новый синтез циклина В; 8 — профаза; 9 — неактивный белковый комплекс, стимулирующий анафазу; 10 — его активация

Регуляция клеточного цикла у млекопитающих

На предыдущей схеме рассмотрены только конечные звенья цепи событий, заканчивающихся делением клетки. Однако, как уже говорилось, деление клетки обязательно связано с репликацией ДНК. Следовательно, должны существовать механизмы, регулирующие запуск синтеза ДНК, а этому должны предшествовать события G₁-периода, подготавливающие начало S-периода. Оказалось, что комплексы Cdk—митотический циклин В — это только конечный этап регуляции клеточного цикла. На самом же деле от начала вхождения в клеточный цикл до его завершения в клетке работает каскад комплексов Cdk - циклин. Так, у дрожжей один и тот же Cdk отвечает за прохождение цикла, но на разных его стадиях он взаимодействует с разными циклинами, характерными для каждой стадии клеточного цикла.

У млекопитающих в реализации всего цикла участвуют девять различных циклинов и семь разных Cdk (рис. 351). Но что является пусковым механизмом для вхождения клеток в цикл из состояния покоя, из G₀-стадии? Мы видели, что для активации клеточного цикла ооцита X. laevis необходимо первоначальное воздействие гормона прогестерона, который в данном случае является фактором роста (ФР, или GF) или пролиферации.

Рис. 351. Участие в клеточном цикле млекопитающих различных циклинов и циклинзависимых киназ 1 — циклин Д + Cdk 4, Cdk 6; 2 — циклин Е + Cdk 2; 3 — циклин А + Cdk 2; 4 — циклин В/А + Cdk 1

Было найдено, что существует множество факторов роста, побуждающих клетки к размножению. Они могут быть собственными продуктами данных клеток (аутокринная стимуляция) или других соседних (паракринная стимуляция), или даже клеток других органов (гормональная стимуляция). Так, фактор роста из тромбоцитов (PDGF) стимулирует пролиферацию клеток соединительной ткани, эпидермальный ФР (EGF) — размножение многих типов клеток, работает как сигнальный белок при эмбриональном развитии; ФР нервов (NGF) вызывает рост отдельных типов нейронов; эритропоэтин — пролиферацию предшественников эритроцитов и т.д.

Хорошим примером зависимости пролиферации клеток от факторов роста могут служить клеточные культуры. Было найдено, что для размножения многих клеточных культур, кроме питательных сред, необходимо добавление сывороток крови или эмбриональных экстрактов. Оказалось, что именно в этих добавках содержатся ФР. Без них клетки переходят в G₀-стадию, а затем погибают. Для роста нервных клеток в культуре требуется добавление в среду фактора роста нервов (NGF).

Эти разные ФР связываются на поверхности клеток со своими рецепторами и передают сигнал через вторичные мессенджеры (например, цАМФ) на систему внутриклеточного каскада протеинкиназ (фосфорилаз), связанных с запуском клеточного цикла. Сначала активируются гены раннего ответа, белки которых индуцируют транскрипцию генов отложенного ответа, некоторые из них сами являются факторами транскрипции, а также индуцируют синтез ряда циклинов и Cdk, которые отсутствовали в G₀-периоде.

Так, вначале синтезируются белки Cdk и циклины, характерные для G₁-стадии, затем для S-фазы и потом для митоза (рис. 352). В G₁-стадии комплекс Cdk—циклин (G₁—CDK) фосфорилирует факторы транскрипции, необходимые для активации экспрессии генов, ответственных за образование синтетического комплекса S-CDK, который после образования инактивируется специальным ингибитором. В конце G₁-периода комплекс G₁-CDK фосфорилирует этот ингибитор, который отделяется от комплекса S—CDK, тем самым его активируя. При этом в первоначальном комплексе G₁—CDK циклин деградирует. Активированный S-CDK-комплекс индуцирует S-фазу, фосфорилируя белки регуляторного участка ДНК, связанных с точками начала репликации. Затем циклин в этом комплексе также деградирует. После активации S-периода происходит репликация ДНК. Во время S-периода и в начале G₂-периода происходит синтез нового митотического комплекса M-CDK, определяющего вхождение клетки в митоз. Однако до окончания синтеза ДНК он находится в неактивном состоянии и активируется путем дефосфорилирования. После активации этого комплекса он участвует в фосфорилировании белков хроматина, что приводит к конденсации хромосом, белков ламины, которые деполимеризуются, и при этом разрушается ядерная оболочка, фосфорилирует ряд белков, ассоциированных с микротрубочками при образовании веретена деления. После ассоциации микротрубочек с хромосомами происходит активация АРС (комплекс стимуляции анафазы), деградация когезинов, вслед за чем наступает анафаза и активация протеолиза митотических циклинов. После расхождения хромосом и цитотомии в раннем G₁-периоде следующего цикла новые комплексы G₁-CDK фосфорилируют АРС, инактивируя их, что способствует впоследствии накоплению митотических циклинов.

Рис. 352. Общая схема регуляции цикла эукариотической клетки 1 — сборка ДНК-репликативных коммлексов; 2 — G1-Cdk-комплекс инактивирует APC (комплекс, стимулирующий анафазу); 3 — G1-Cdk-комплекс активирует транскрипцию Cdk-комплекса S-фазы; 4 — G1-Cdk-комплекс фосфорилирует ингибитор Cdk-комплекса S-фазы; 5 — деградация этого ингибитора; 6 — Cdk-комплекс S-фазы активирует репликативные комплексы; 7 — митотический Cdk-комплекс (М-Cdk) активирует конденсацию хромосом, разрыв ядерной оболочки, сборку веретена деления; 8 — активирование АРС; 9 — АРС разрушает анафазный ингибитор, что приводит к расхождению хромосом в анафазе; 10 — АРС вызывает деградацию митотического циклина с помощью протеосом; 11 — телофаза и цитокинез

Контрольные точки клеточного цикла

Наличие контрольных точек в клеточном цикле необходимо для определения завершения его каждой фазы. Остановка клеточного цикла происходит при повреждении ДНК в G₁-периоде, при неполной репликации ДНК в S-фазе, при повреждении ДНК в G₂-периоде и при нарушении связи веретена деления с хромосомами.

Одним из контрольных пунктов в клеточном цикле является собственно митоз, который не переходит в анафазу при неправильной сборке веретена и при отсутствии полных связей микротрубочек с кинетохорами. В этом случае не происходит активации АРС-комплекса, не происходит деградации когезинов, соединяющих сестринские хроматиды, и деградации митотических циклинов, что необходимо для перехода в анафазу.

Повреждения ДНК препятствуют вхождению клеток в S-период или в митоз. Если эти повреждения не катастрофические и могут быть восстановлены за счет репаративного синтеза ДНК, то блок клеточного цикла снимается, и цикл доходит до своего завершения. Если же повреждения ДНК значительные, то каким-то образом происходят стабилизация и накопление белка р53, концентрация которого в норме очень низкая из-за его нестабильности. Белок р53 является одним из факторов транскрипции, который стимулирует синтез белка р21, являющегося ингибитором комплекса CDK-циклин. Это приводит к тому, что клеточный цикл останавливается на стадии G₁ или G₂. При блоке в G₁-периоде клетка с повреждением ДНК не вступает в S-фазу, так как это могло бы привести к появлению мутантных клеток, среди которых могут быть и опухолевые клетки. Блокада в G₂-периоде также предотвращает процесс митоза клеток с повреждениями ДНК. Такие клетки, с блокированным клеточным циклом, в дальнейшем погибают путем апоптоза, программированной клеточной гибели (рис. 353).

Рис. 353. Остановка клеточного цикла в результате нарушения синтезa ДНК или ее повреждения, что ведет к возрастанию синтеза белка р53, который в свою очередь индуцирует синтез белка р21 — ингибитора клеточного цикла

При мутациях, приводящих к потере генов белка р53, или при их изменениях, блокады клеточного цикла не происходит, клетки вступают в митоз, что приводит к появлению мутантных клеток, бóльшая часть из которых нежизнеспособна, другая — дает начало злокачественным клеткам.

Величко В.В. © Copyright 2008.